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共沉淀法是什么|原理圖(共沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)及方法有哪些)
Co-IP是一種基于抗原與抗體的專一性結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法,廣泛應(yīng)用于檢測生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。
產(chǎn)品類別: 共沉淀法是什么|原理圖(共沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)及方法有哪些)
產(chǎn)品名稱: 共沉淀法是什么|原理圖(共沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)及方法有哪些)
更新時(shí)間: 2022-11-23 07:49:02
產(chǎn)品型號(hào): Co-IP是一種基于抗原與抗體的專一性結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法,廣泛應(yīng)用于檢測生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。

  共沉淀法是什么|原理圖(共沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)及方法有哪些)



  生物個(gè)體的許多生命活動(dòng)過程都與蛋白質(zhì)相互作用有密切的聯(lián)系,因此隨著生命科學(xué)研究的不斷深入,研究蛋白質(zhì)相互作用成為了揭示各種生命活動(dòng)機(jī)制的必要步驟。迄今已經(jīng)發(fā)展出了多種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)和方法,例如免疫共沉淀,酵母雙雜交技術(shù),雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù),熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)和串聯(lián)親和純化聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法等。

  Co-IP是一種基于抗原與抗體的專一性結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法,廣泛應(yīng)用于檢測生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。這種方法常用于鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否存在相互作用,也可以用于確定某種已知蛋白質(zhì)和其他未知蛋白質(zhì)之間的相互作用。

  Co-IP的基本原理:首先在非變性條件下使用溫和的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,此時(shí)存在于完整細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用被保留了下來。隨后向細(xì)胞裂解液中加入偶聯(lián)某種抗體的瓊脂糖珠并進(jìn)行孵育。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)A被其抗體特異識(shí)別并結(jié)合后,A可以與其抗體免疫沉淀,那么在細(xì)胞內(nèi)與A存在相互作用的蛋白質(zhì)或者蛋白復(fù)合物B也能沉淀下來。利用洗脫液洗脫沉淀下來的蛋白,通過Western blotting對這些蛋白進(jìn)行鑒定和分析。

  實(shí)驗(yàn)方法

  收集已同時(shí)表達(dá)蛋白X和蛋白Y的細(xì)胞。

  吸凈細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS小心漂洗一次,然后加入500μl預(yù)冷的Lysis/IP buffer,于冰上放置15 min,每隔幾分鐘晃動(dòng)一次。

  將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi),于4℃,13,000 rpm離心5 min。

  將離心后的上清留取少量樣品后(所留樣品加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液,混合后,于100℃煮沸5 min,離心后放置-20℃保存?zhèn)溆茫瑢Φ鞍缀窟M(jìn)行定量,補(bǔ)充Lysis/IP buffer至1 ml左右,然后分別加入50μl 50%的Progein G beads,于4℃環(huán)境下,將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)1 h以除去Protein G beads非特異結(jié)合的蛋白。

  于4℃,13,000 rpm離心5 min,將上清液再次轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管內(nèi),加入1μl的正常小鼠IgG或者是FLAG單克隆抗體,于4℃環(huán)境下,將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)1 h,使抗體與蛋白進(jìn)行特異結(jié)合。

  加入50μl 50%的Protein G beads,于4℃環(huán)境下,將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)1 h,使Protein G beads與抗體結(jié)合。

  于4℃,13,000 rpm離心5 min,棄上清,然后用Lysis/IP buffer洗滌三次,每次都在4℃環(huán)境下,將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉(zhuǎn)15 min。

  最后一次洗滌完畢,棄上清,管中只剩下beads,加入25μl的2×蛋白上樣緩沖液,混合后,于100℃煮沸5 min,離心后即可上樣SDS-PAGE膠或者放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

  注意事項(xiàng)

  細(xì)胞裂解要采用溫和的裂解條件,避免破壞細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白間相互作用,裂解、洗滌時(shí)需使用非變性裂解液,如NP-40和Triton X-100。

  由于不同細(xì)胞裂解條件不一樣,建議通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定最佳條件。

  抗體的選擇十分重要,選經(jīng)過IP驗(yàn)證的抗體,可以減少假陽性概率。

  注意抗體/緩沖液的比例,抗體稀釋過度不利于后續(xù)抗原抗體結(jié)合;而抗體過多就不能完全沉降在固相基質(zhì)上,殘存于上清。

  操作時(shí),為了避免損傷beads,使用大口徑或截短槍頭進(jìn)行加樣。



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